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4月24日，《細(xì)胞》（Cell）以Research Article的形式，在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心孟飛龍研究組等撰寫的題為Mesoscale DNA Feature in Antibody-Coding Sequence Facilitates Somatic Hypermutation的最新成果。該研究基于經(jīng)典生化方法與高通量測序技術(shù)，建立了體外檢測抗體基因超突變的一系列新方法，從而揭示了抗體基因互補決定區(qū)（CDR）通過高度柔性特征引發(fā)超高突變的分子機理。胞苷脫氨酶AID在B淋巴細(xì)胞中啟動了抗體基因超突變，其蛋白表面具有大片正電荷片區(qū)；而抗體基因CDR編碼區(qū)域DNA序列則在進化中獲得了高度柔性的特征。酶與底物的協(xié)同進化共同促進了CDR區(qū)的超突變偏好。該工作為下一代抗體基因人源化動物模型的設(shè)計提供了底層理論。

抗體作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵效應(yīng)分子，時刻守衛(wèi)著機體的健康。面對復(fù)雜多變的外界環(huán)境，機體的免疫系統(tǒng)通過抗體多樣化機制產(chǎn)生數(shù)量龐大的抗體分子，從而特異性地識別和清除病原體。抗體多樣化通常包含兩個主要步驟：一是核酸內(nèi)切酶RAG介導(dǎo)的的V(D)J重排過程，二是胞苷脫氨酶AID起始的體細(xì)胞超突變（SHM）和抗體類型轉(zhuǎn)換（CSR）過程。體細(xì)胞超突變可在抗體基因的可變區(qū)編碼區(qū)引入高頻突變。然而，超突變在抗體可變區(qū)外顯子上并非均勻分布，而偏好性積累在可變區(qū)中的互補決定區(qū)（CDR）。超突變?yōu)槭裁淳哂衅眯?，這是免疫學(xué)家David Baltimore與Klaus Rajewsky在20世紀(jì)80年代提出的問題。近40多年來，該領(lǐng)域的科學(xué)家嘗試從多個角度去解釋這一現(xiàn)象，但尚未有令人信服的結(jié)論。CDR偏好突變科學(xué)問題的解決亟需引入新的概念。胞苷脫氨酶AID是一個僅含198個氨基酸的蛋白質(zhì)。生化實驗證明，AID作用于單鏈DNA底物，且偏好作用于WRC(W=A/T, R=A/G)基序。然而，WRC基序不能解釋抗體基因CDR偏好超突變，這是由于同樣的WRC基序在CDR編碼區(qū)突變率超高。在CDR編碼區(qū)的中尺度（5-50bp）中，AID可能受到局部序列的調(diào)控。

孟飛龍研究組長期致力于免疫受體多樣化機制研究。在最新研究中，科研人員從經(jīng)典的生化方法出發(fā)聯(lián)合高通量測序技術(shù)，建立了體外檢測抗體基因突變的新體系，發(fā)現(xiàn)了AID酶活反應(yīng)重現(xiàn)小鼠體內(nèi)抗體基因突變譜式。進一步，該研究將生化實驗的DNA底物擴展到27種有頜脊椎動物的1000余條抗體基因序列，發(fā)現(xiàn)CDR突變偏好在使用體細(xì)胞高頻突變（SHM）作為抗體主要多樣化策略的四足動物（包括人、恒河猴、食蟹猴、小鼠、大鼠、狗、鴨嘴獸以及羊駝等）中高度保守。那么，這種突變偏好是否受DNA序列上下文的影響？

為了回答上述問題，研究人員在小鼠體內(nèi)將一段抗體基因的DNA序列進行隨機置換，發(fā)現(xiàn)序列改變后突變頻率發(fā)生了顯著變化。這提示不同的DNA序列上下文中可能含有未知的中尺度順式因子，從而調(diào)控突變頻率的作用。因此，研究通過基因編輯在CDR3區(qū)引入隨機序列改變，快速獲得十幾種攜帶不同CDR3序列環(huán)境的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)了序列改變越靠近CDR3區(qū)內(nèi)的突變熱點對該位點的突變頻率影響越大。因此，研究繼續(xù)將序列上下文范圍縮小到突變位點上下游各12-15 nt。

通過分子動力學(xué)模擬和多種單分子生化實驗，研究發(fā)現(xiàn)中尺度中DNA序列柔性越大越利于結(jié)合AID表面的正電荷片區(qū)，進而越有助于突變的發(fā)生。單鏈DNA的柔韌性與嘧啶-嘧啶二核苷酸的含量呈正相關(guān)。此外，通過分析抗體基因序列特征以及突變譜式，研究發(fā)現(xiàn)抗體基因CDR的編碼序列在進化中獲得了高度柔性的特征?？蒲腥藛T分別在B細(xì)胞系和小鼠體內(nèi)將一段柔性序列插入突變低頻區(qū)FR，發(fā)現(xiàn)柔性序列提高了FR的突變頻率。

綜上，該研究解答了長期困擾這一領(lǐng)域的難題，發(fā)現(xiàn)了抗體基因CDR編碼區(qū)DNA柔性促進偏好性突變的發(fā)生以及抗體基因編碼序列具有調(diào)控AID突變靶向的非編碼功能。這一工作為DNA力學(xué)性質(zhì)參與調(diào)控細(xì)胞生命過程中提供了例證，并提示DNA柔性等力學(xué)性質(zhì)可能在其他生命活動如腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。中尺度序列特征的發(fā)現(xiàn)，為設(shè)計下一代抗體基因人源化動物模型構(gòu)筑了底層理論。

該研究由分子細(xì)胞卓越中心和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院合作完成。上海師范大學(xué)科研人員在數(shù)據(jù)分析，上海交通大學(xué)科研人員在分子動力學(xué)模擬，美國哈佛大學(xué)科研人員在模型構(gòu)建等方面作出了重要貢獻。研究工作獲得國家自然科學(xué)基金、科技部、中科院、上海市科學(xué)技術(shù)委員會等的資助，并得到上海交通大學(xué)、美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、瑞典卡羅林斯卡研究所、中科院杭州醫(yī)學(xué)所、中科院生物物理研究所和復(fù)旦大學(xué)等的科研人員以及分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心動物實驗技術(shù)平臺、細(xì)胞分析技術(shù)平臺和分子生物學(xué)技術(shù)平臺的支持。